第一指导教师主要成果：

第二指导教师主要成果：

一、申请理由：无

二、项目方案：

1.基于表面等离激元增强拉曼光谱技术的饮用水中微纳塑料分析新方法的建立与应用，国家自然科学基金青年基金（2021/01-2023/12） 来永超，24万        

2. 基于表面增强拉曼光谱的丙二醛活体实时监测技术研究，山东省自然科学基金青年项目（2021/01-2023/12） 来永超，14万

3. 公安部重点实验室重点项目：“基于指甲中药物及其代谢物分布特点推断  供体用药行为的研究”, No. 2021FTDWFX04 2021.07—2022.07  4万元  李荀，在研

4. 山东省自然科学基金面上项目 “以13b为先导结构的新型药物分子设计、合成与生物活性研究”No. ZR2018MH042  2018.03—2021.03  18万元  李荀，已结题

5. 山东省重大科技创新工程项目“新型冠状病毒肺炎潜在药物临床评价研究”No.2020SFXGFY07, 2020.03—2021.01  15万元，李荀，已结题

6. 中澳国际合作课题“Shinning a light on effective cancer therapy”No. 2018GJ07  2018.01—2021.12  5万元，李荀，在研

7. 公安部重点实验室重点项目：“毛发中甲基苯丙胺的迁移及外源性干扰因素研究”, No. 2019FTDWFX01 2019.04—2021.03  6万元  李荀，已结题

8. 教育部在线教育研究基金（全通教育）项目：“构建基于云班课的虚拟学习社区及其促进在线学习粘性的研究” No 2017YB144, 2017.01—2017.12  8万元 李荀，已结题

9. 山东省重点研发计划项目基金“基于非共价作用的HSA-LCFA肿瘤靶向长效载药技术” No 2016GSF201175,  2016.01—2018.12  12万元  李荀，已结题

10. 国家自然科学基金 “P-gp特异性抑制剂的设计、合成与多药耐药逆转活性研究”课题负责人 No 30701053  2008.01—2010.12  16万元  李荀，已结题

11. 中澳国际合作课题  课题负责人 “新型荧光镧系配合物在肿瘤诊断中的应用”No 2015GJ07  2015.01—2016.12   6万元  李荀，已结题

12. 教育部博士点青年基金 课题负责人“小分子类肽氨肽酶N/CD13抑制剂的设计、合成与抗癌活性研究”No 20070422061  2008.01—2010.12  3.6万元  李荀，已结题

13. 山东省自然科学基金面上项目 “构建噁唑啉环的小分子类肽化合物及其抗肿瘤活性评价”No ZR2013HM101  2013.10—2016.10  10万元  李荀

14. 日中医学会国际合作课题 课题中方负责人 “吡咯烷类化合物的抗肝癌活性研究”日中医发第103号批件2008.01—2008.12  李荀，已结题

15. 山东省自然科学基金面上项目 课题负责人 “基于氨肽酶N/CD13为靶点的抗癌药物研究”No Y2008C01  2008.12—2011.12 5万元  李荀为靶标的抗癌先导结构的发现”No 2009TS113  2009.12—2012.12  10万元，已结题

三、学校提供条件：指导教师曾经指导大学生获得2017年度“挑战杯”省赛二等奖、国家级大学生科创一等奖、山东大学创新创业大赛-创新组特等奖、山东大学创新创业大赛-创业组特等奖，具有指导大学生比赛的经验，不仅提供该项目所需的仪器和实验场地，对该项目全程进行指导。

四、预期成果：

（1）发展一种可与MDA可逆加合的SERS微探针。

（2）建立生物组织中MDA的定性和定量检测方法。

（3）实现生物体内MDA浓度的空间和时间监测。

（4）开发一种可用于实时监测生物体中内源毒性化合物的表面增强拉曼光谱分析方法。

五、经费预算：

本研究将致力于通过化学合成和修饰技术来制备可与MDA可逆加合的SERS微探针，通过MDA加合物的指纹拉曼光谱图，特异性识别生物体内的MDA，利用微探针的动态结合能力和SERS技术的高空间分辨能力，实现生物体内MDA浓度的空间和时间监测，并初步用于氧化应激过程中脂质过氧化的研究。

（1）可与MDA可逆加合的SERS微探针的制备

        <1> 高性能的SERS基底的制备

        高性能的SERS基底是本项目的基础，SERS基底的性能决定了能否获取高质量的MDA加合物的指纹拉曼光谱图。高性能的SERS基底不仅要具有较高的增强因子，还必须具有良好的空间均匀性和时间稳定性。作为一种微区分析技术，基底的空间均匀性和时间稳定性是决定SERS分析可信度的基础。纳米银结构具有最好的表面增强拉曼散射效应，铜银间置换反应是高性能SERS基底的高效低成本制备方法，控制金属银纳米结构稳定生长在铜箔基底上是其中的关键所在。

        <2> SERS基底的特异功能化修饰

        SERS基底的特异功能化修饰是MDA检测的前提，SERS基底的增强能力会随着目标分子在几纳米范围内远离基底表面而急剧衰减，MDA分子对SERS基底的亲和力很弱，并且生物体内基质复杂，各种生物大分子会与MDA分子在SERS基底表面吸附，极大地降低SERS测定MDA的灵敏度和特异性。如图一所示对SERS基底进行特异功能化修饰，一方面可以尽量隔绝生物大分子对基底的非特异性吸附，另一方面可以特异性识别MDA分子。通过SERS基底的特异功能化修饰提高SERS基底对MDA的表面富集能力，阐明MDA分子的表面加合方式和动力学过程，研究MDA分子在样品相与表面富集层之间的平衡模式。

                              

图一、表面增强拉曼光谱原位检测MDA过程示意图

（2）建立模拟生物组织中MDA检测的定性和定量方法

        <1> 在模拟生物组织中MDA检测的定性方法

        MDA分子的拉曼散射截面相对较小，难以通过直接检测MDA分子的SERS信号实现MDA分子的定性，我们将MDA加合到拉曼散射截面较大的信号分子上，通过加合作用将MDA分子的特征拉曼信号加合到信号分子上，实现MDA分子SERS信号的高强度输出。通过MDA与SERS微探针的相互作用实现MDA分子在生物体内复杂环境中的精准识别，利用MDA加合物的特征拉曼峰谱组，可以有效的定性识别MDA分子，避免其他活性分子的信号干扰。

        <2> 在模拟生物组织中MDA检测的定量方法

        MDA分子在SERS微探针上的可逆加合行为符合Freundlich 模型，在Freundlich 模型中，加合量与MDA浓度可以写成如下线性方程：

       logQe=logKF+1nlogCe,                            (1)

        其中Q_e是平衡加合量, C_e代表加合后MDA在生物组织内的浓度, K_F是加合常数。SERS过程中涉及到的MDA加合物分子数量（N）和平衡加合量Q_e遵循如下线性关系:

       N=aQe.                                                        (2)

        其中a为常数。

        SERS信号强度（I_SERS)有下列方程式表示:

       ISERS∝NILAυL2AυS2σabsR                       (3)

        其中，I_L 代表入射激光强度,AυL和AυS代表入射场和散射场的增强因子，σabsR代表MDA加合物分子的有效拉曼散射截面，在固定入射激光强度和SERS增强基底的情况下，公式（3）可以被写为如下形式:

       ISERS=bN                                                                  (4)

        其中b是与其他参数无关的常数。

        综合公式（1）-（4），可以得到如下公式：

       logISERSab=logKF+1nlogCe,                   (5)

        公式（5）经重排可以写成如下形式

       logISERS=logab+logKF+1nlogCe.                       (6)

        在我们的微探针上加合的MDA分子数量非常小，组织中的MDA分子浓度在加合前后几乎没有变化，因此我们可以认为与微探针加合后MDA在生物组织内的浓度C_e近似等于MDA在组织中的初始浓度C₀，利用这个近似，可以得到如下的关系式：

       logISERS= h+klogCe                                                  (7)

        其中h，k均为与其他参数无关的常数。

        通过公式（7）我们可以建立MDA在生物组织内的浓度与SERS信号强度之间的关系，从而实现MDA分子的定量检测。

（3）生物体内MDA浓度的空间和时间监测

        <1>  SERS微探针的生物毒性研究

        SERS微探针的生物毒性是决定该技术能否用于生物体内MDA的原位监测的前提，考察SERS微探针及其采样行为对细胞和小鼠的急性毒性和中长期毒性，并采取相应措施最大化减少对生物体的危害。

        <2> 微米尺度MDA浓度的空间和时间监测

        MDA主要通过过氧化细胞膜产生，组织内不同区域细胞氧化应激产生的MDA浓度不同。SERS微探针的针尖尺寸关系到测试MDA浓度的空间精度，通过SERS微探针精细针尖部位，精细探查组织内不同区域细胞甚至单个细胞不同区域MDA的空间和时间变化。

        <3> 小鼠体内MDA浓度的空间和时间监测

        拉曼光谱仪所用激光波长的组织穿透深度关系到最大可监测深度，受到特定刺激（化学品、受伤、辐射等）后，氧化应激的小鼠模型体内不同位置和时间的MDA浓度变化是分析MDA相关的生理和病理过程直接性的原位证据。

项目附件：查看附件

一、项目实施情况：一、项目实施情况： （一）研究目标 （1）发展一种可与MDA可逆加合的SERS微探针。 （2）建立生物组织中MDA的定性和定量检测方法。 （3）实现生物体内MDA浓度的空间和时间监测。 （4）开发一种可用于实时监测生物体中内源毒性化合物的表面增强拉曼光谱分析方法。 （二）研究过程 本研究将致力于通过化学合成和修饰技术来制备可与 MDA 可逆加合的 SERS 微探针，通过 MDA 加合物的 指纹拉曼光谱图，特异性识别生物体内的 MDA，利用微探针的动态结合能力和 SERS 技术的高空间分辨能 力，实现生物体内 MDA 浓度的空间和时间监测，并初步用于氧化应激过程中脂质过氧化的研究。 （1）可与 MDA 可逆加合的 SERS 微探针的制备 <1> 高性能的 SERS 基底的制备 高性能的 SERS 基底是本项目的基础，SERS 基底的性能决定了能否获取高质量的 MDA 加合物的指纹拉曼 光谱图。高性能的 SERS 基底不仅要具有较高的增强因子，还必须具有良好的空间均匀性和时间稳定性。作 为一种微区分析技术，基底的空间均匀性和时间稳定性是决定 SERS 分析可信度的基础。纳米金、纳米银在 SERS 检测中表现出较好的拉曼检测效果并在 SERS 上得到广泛运用，本实验探究不同纳米结构对反应监测性 能进行分析从而获得具有较高 SERS 效果的 Au@Ag NPs 基底。 <2> SERS 基底的特异功能化修饰 SERS 基底的特异功能化修饰是 MDA 检测的前ᨀ，SERS 基底的增强能力会随着目标分子在几纳米范围内 远离基底表面而急剧衰减，MDA 分子对 SERS 基底的亲和力很弱，并且生物体内基质复杂，各种生物大分子 会与 MDA 分子在 SERS 基底表面吸附，极大地降低 SERS 测定 MDA 的灵敏度和特异性。如图一所示对 SERS 基 底进行特异功能化修饰，一方面可以尽量隔绝生物大分子对基底的非特异性吸附，另一方面可以特异性识别 MDA 分子。通过 SERS 基底的特异功能化修饰ᨀ高 SERS 基底对 MDA 的表面富集能力，阐明 MDA 分子的表面加 合方式和动力学过程，研究 MDA 分子在样品相与表面富集层之间的平衡模式。PATP 具有较大的拉曼散射面 积并与 MDA 具有较大的亲和能力，并在实际检测过程中得到证实，因此经 PATP 特异功能化的 SERS 基底被选 为本实验室基底材料。 图一、表面增强拉曼光谱原位检测 MDA 过程示意图 （2）建立模拟生物组织中 MDA 检测的定性和定量方法 <1> MDA 检测的定性方法 MDA 分子的拉曼散射截面相对较小，难以通过直接检测 MDA 分子的 SERS 信号实现 MDA 分子的定性，我们 将 MDA 加合到拉曼散射截面较大的信号分子上，通过加合作用将 MDA 分子的特征拉曼信号加合到信号分子 上，实现 MDA 分子 SERS 信号的高强度输出。通过 MDA 与 SERS 微探针的相互作用实现 MDA 分子在生物体内复 杂环境中的精准识别，利用 MDA 加合物的特征拉曼峰谱组，可以有效的定性识别 MDA 分子，避免其他活性分 子的信号干扰。 <2>MDA 检测的定量方法 PATP 被用作 SERS 微探针来检测 MDA，并阻止生物大分子在 SERS 基底上的非特异性吸附。将 PATP （100.00 μL，0.10 mM）加入到 Au@Ag NPs（1.00 mL），然后加入不同浓度的 MDA 溶液（100.00 μL） （1.00, 3.00, 5.00, 8.00, 和 10.00 μM）。在均匀混合后，将溶液在 40℃孵化 15 分钟后进行拉曼检测。 拉曼测量在单一时间内进行，曝光时间为 100 毫秒，激光功率为 300 毫瓦，光谱范围为 200-2700 cm-1 ，所有 的光谱均采用基线校正。 获得 MDA 线性浓度范围为在 0.50 μM–0.10 mM。每个样品分别测量三份，计算平均值。SERS 的强度峰 值为 1663 cm-1 ,这是 MDA-PATP 的特征峰，用于 MDA 的定量分析。为了消除波动及ᨀ高该方法的准确度，选 择 1083 cm-1 作内标峰，因为该峰在反应前后是一致的，这是 PATP 的特征峰。所ᨀ方法的精密度在实际应用 中至关重要。为了评估这一点，进行了五次平行实验，分析不同浓度（1.00、3.00、5.00、8.00 和 10.00 μM）的 MDA。五种浓度均具有良好的重复性，1.00、3.00、5.00、8.00 和 10.00 μM 的相对标准偏差 （RSD）分别为 7.41%，3.97%、0.77%、4.48% 和 2.85 %，这些结果表明，该方法显示高的检测精密度，可 用于 MDA 检测。 对样品进行拉曼检测后绘制峰强比和浓度图谱，MDA 浓度为 1.00-10.00 μM,并对所获结果进行线性拟 合得到 R 2 =0.987。同时本方法检测限为为 0.50 μM（三倍信噪比）。 （3）生物样品 MDA 浓度检测 MDA 主要通过过氧化细胞膜产生，组织内不同区域细胞氧化应激产生的 MDA 浓度不同。SERS 微探针的针 尖尺寸关系到测试 MDA 浓度的空间精度，通过 SERS 微探针精细针尖部位，精细探查人体血浆 MDA 含量来预 测疾病。 使用新鲜的血浆样品评估了拟议方法的可行性。一部分 100.00 μL 的酸化血浆样品（1% 硫酸 ）加入 到 100.00 μL PATP 和 1.00 mL Au@Ag NPs 溶液。在 40℃下孵化 15 分钟后，对样品进行拉曼检测以确定 MDA 浓度。用老化的血浆样品评估了拟议方法的回收率。将 MDA 添加到老化三天以上的血浆样品中，获得相 应 MDA 浓度（0.00、3.00、5.00、8.00 和 10.00 μM）。随后，通过本实验方法测定样品，并获得样品中 MDA 浓度。 本实验对血浆样品检测，检测出人体血浆样品 MDA 浓度分别 3.15, 4.61, 0.51, 2.46, 和 2.46 μM， 本结果与以往实验获得结果接近。此外，对本实验进行血浆加样回收率实验，MDA 的总体回收率 93.80%和 95.07%之间且 RSD 低于 5.30%。

二、项目创新点与特色：（1）本项目利用可与 MDA 可逆加合的 SERS 微探针，通过 MDA 加合物的指纹拉曼光谱图，特异性识别生物体 内的 MDA，避免了生物体内其他物质的干扰。 （2）MDA 在生物体内浓度具有动态性， 空间和时间分布高度不均。本项目利用 SERS 微探针，实时高空间分 辨的监测 MDA 浓度，ᨀ供分析 MDA 相关的生理和病理过程直接性的原位证据。 

三、项目成果：
项目申请书中的预期成果及成果提交形式
公开发表论文：1(篇)，专利：0(项)，调查报告：0(份)，软件、著作：0(份)实物：0(件)，竞赛获奖：0(次)，其它：
项目结题时取得的成果
公开发表论文：1(篇)，专利：0(项)，调查报告：0(份)，软件、著作：0(份)实物：0(件)，竞赛获奖：0(次)，其它：
项目主要研究成果情况

序号	成果名称 （获奖名称及等级）	成果形式	作者（获奖者）	出版社、发表刊物 或颁奖单位	时间（刊期）
1	Robust and reliable detection of malondialdehyde in biological samples via microprobe-triggered surfaceenhanced Raman spectroscopy	论文	武哲 王英杰	Microchemical Journal	2022.07.29

四、研究体会和心得：项目组成员在实验进行初期，采用银纳米颗粒、金纳米盒子、银包金分别作为 SERS 基底对 MDA 进行拉曼 光谱扫᧿从而检测不同 SERS 基底对 MDA 的拉曼增强效应。课题组各成员分工明确，恪尽职守，身体力行。但 是实验中问题层出不穷，通过文献的查阅、各个成员之间的讨论以及指导老师的帮助，实验在稳步进行。在此 阶段，我们深刻感受到了“站在巨人肩膀上”的“愉悦与满足感”，同时，分工协作、团结一致也是必不可少 的。 实验中期，①SERS 基底选择；②SERS 基底优化；③待测产物的特征吸收；④反应机理的研究。在此期 间，课题组各成员一周开一次例会，不断交流，在实验中改进研究方法与细节，并对试验中存在的问题进行 探讨，保障实验稳步进行。同时我们深刻认识到了“交流的火花的力量”，文献初步的研究是基础，后期的 实验是需要在基础之上不断调整、不断改进的。大量的实验数据是实验的支撑骨架。 实验末期，完成了剩余的工作，主要是论文的撰写与修改，在此过程中，课题组各成员的文献阅读能力、 交际能力及英文水平等均得到了较好的ᨀ升。另外，修改论文的过程也是一个磨练心性的过程，耐心、严谨细 致、数据分析、规范化书写都在潜意识中发生着改变，为我们以后进一步的进修奠定了良好的基础

五、经费使用明细情况：
项目获批总经费：15000(元)，项目实际投入经费：9000(元)，实际使用资金：9000(元)，结余资金：0(元)
项目经费开支情况

名目	用途	金额(元)	备注
论文版面费
专利申请费
调研、差旅费
打印、复印费
资料费
试剂等耗材费	实验试剂耗材		9000
元器件、软硬件测试、小型硬件购置费
其它

指导教师意见：项目组成员可以较好的完成科研预期内容，态度端正，做事严谨细致，不断地改进与改善实验条件，在 一年多的准备和筹划中现已将基本目标完成，并获得相应成果。并在此期间反复调整项目细节，并不断对项 目开展状况进行讨论，确保项目可切实有效顺利地开展。且多次查阅文献并在测量过程中不断改进测量方法， 满足科研需求的同时做到厉行节俭的宗旨。并在工作开展中始终保证项目组成员之间的密切沟通，保证实验 数据的准确性，增强实验可信度。项目开展情况良好，因为项目已ᨀ前完成，且项目组成员各方面学业需求 和学业安排，特批准其结题。