1、项目进展情况及取得成绩
我们前期通过双荧光素酶报告基因系统筛选出了抑制NF-κB信号通路活性的中药单体脱氢吴茱萸碱(DDA)。首先构建NF-κB启动子报告基因载体并转染入HEK293T细胞中，经多种中药单体处理后，检测不同中药单体对NF-κB启动子活性的影响，我们发现DDA能够显著抑制NF-κB的启动子活性。在此基础上，我们对上述细胞分别使用炎性因子IL-1β（图1，A）和TNF-α（图1，B）预处理，并采用荧光素酶法检测，发现与对照组相比，DDA显著抑制NF-κB的启动子活性。上述结果提示，脱氢吴茱萸碱（DDA）具有降低NF-κB启动子活性的功能。
图1
为明确中药单体脱氢吴茱萸碱DDA对RA FLS细胞功能的影响。首先我们利用CCK8法检测DDA对RA FLS增殖活性的影响，如图2A所示，对炎性因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）刺激后的RA FLS给予DDA处理，我们发现DDA处理组的RA FLS增殖速率与对照组相比显著降低，说明DDA可有效抑制炎性因子诱导的细胞增殖活性。我们又利用Annexin V法检测DDA对RA FLS凋亡的影响，发现DDA处理组的RA FLS的凋亡比例显著升高（图2，B），说明DDA可以有效促进炎性因子诱导的细胞凋亡。此外，我们又利用ELISA法检测了DDA对RA FLS分泌炎性因子的影响，实验结果表明DDA有效降低了RAFLS中炎性因子的分泌(图2，C)，上述结果说明，DDA有效的抵抗了炎性因子对RA FLS增殖、凋亡以及分泌炎性因子的影响。
图2
为了明确脱氢吴茱萸碱（DDA）对胶原诱导关节炎模型中关节炎发生发展的影响。我们进行了动物实验，将小鼠分成对照组、模型组、低剂量预防组(10mg/kg)和高剂量预防组(20mg/kg)，每组10只。在胶原诱导关节炎小鼠（CIA）和人TNF-α转基因小鼠(hTNFtg)第二次胶原诱导第1天通过腹腔注射给予DDA，隔天给药一次，统计结果如图3所示,不同剂量的DDA对关节炎小鼠都具有预防作用，剂量为20mg/ml时，预防作用更显著。上述结果说明，DDA对关节炎的预防具有显著作用。
图3
2、已达到预期效果
3、存在问题：
①实验的成功率有待提高
②实验的熟练度、精确度有待提高
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