二、项目方案:1. 山东省科技厅,山东省优秀青年基金项目,ZR2020YQ55,PADI4介导的瓜氨酸化在天然抗病毒反应中的作用和机制研究,2021-01至2023-12,40万元,在研,主持
2. 国家自然科学基金委员会,面上项目,81772760,ATF6α介导的未折叠蛋白反应在前列腺癌恶性进展中的作用及机制研究,2018-01至2021-12,60万元,在研,参加
3. 国家自然科学基金委员会,面上项目,81572544,PADI2介导的瓜氨酸化作用在CRPC中的功能及机制研究,2016-01至2019-12,65万元,已结题,参加
4. 国家自然科学基金委员会,青年项目,81300426,PADI4靶向调控SOX4在白血病细胞定向分化中的作用及关键机制研究,2014-01至2016-12,23万元,已结题,主持
5. 国家自然科学基金委员会,青年项目,81302239,TXNDC5在前列腺癌中的功能及关键机制的研究,2014-01至2016-12,23万元,已结题,参加
6. 山东省卫生厅,山东省医药卫生科技发展计划项目,2013WS0365,PADI4在白血病细胞分化过程的机制及应用研究,2014-01至2016-12,2万元,已结题,主持
三、学校提供条件:本项目的选题是建立在指导教师前期研究基础之上的;另外指导教师将从课题设计、操作技能培训、数据处理及文章撰写及课题资助等各方面给予全面辅导与支持。
四、预期成果:
1、明确中药单体脱氢吴茱萸碱DDA对RA FLS炎性反应和凋亡异常的影响。
2、揭示中药单体脱氢吴茱萸碱DDA在RA FLS中影响炎性反应和凋亡异常的分子机制。
3、阐明中药单体脱氢吴茱萸碱DDA临床治疗RA的潜力。
五、经费预算:
1. 筛选和验证抑制NF-κB信号通路活性的中药单体
1.1 双荧光素酶报告基因筛选:构建NF-κB启动子报告基因载体并转染入HEK293T细胞中,经中药单体处理后,检测炎性因子对双荧光素酶活性影响。筛选出抑制NF-κB信号通路活性的中药单体脱氢吴茱萸碱DDA。
1.2 RA FLS 原代培养:采用Ⅱ型胶原酶消化 RA 患者滑膜组织,0.25%胰蛋白酶(不含 EDTA)消化细胞,70μm细胞筛网过滤细胞,用含10%FBS和1%青、链霉素的DMEM培养基培养细胞。使用第四代至第六代的细胞进行后续实验。
1.3中药验证:中药单体脱氢吴茱萸碱DDA处理后,炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)刺激RA FLS,采用Western blot和免疫细胞荧光技术检测 NF-κB p105/p50 的表达和细胞定位。
2.阐明中药单体DDA对RA FLS炎性反应和凋亡异常的影响
为明确中药单体脱氢吴茱萸碱DDA对RA FLS细胞功能的影响,对炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)刺激下的RA FLS给予DDA处理,开展如下功能学实验:
a. CCK-8法检测细胞增殖;
b. Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡;
c. 划痕实验检测细胞迁移;
d. Transwell实验检测细胞侵袭;
e. HUVEC血管生成实验;
f. ELISA实验检测细胞因子,包括: 炎性因子(IL-1α、IL-6、IL-8)、金属基质蛋白酶(MMP-3、MMP-9)、趋化因子(MCP-1、CXCL2)。
3. 中药单体DDA对胶原诱导关节炎发生发展的影响
3.1 DDA对关节炎的预防效果
3.1.1 分成对照组、模型组、低剂量预防组(10mg/kg)和高剂量预防组(20mg/kg),每组10只。在胶原诱导关节炎小鼠(CIA)和人TNF-α转基因小鼠(hTNFtg)第二次胶原诱导第1天通过腹腔注射给予DDA,隔天给药一次。按照如下方案检测对关节炎进展的影响。
1)关节红肿出现时间及肿胀度;
2)关节炎指数评分;
3)关节炎发病率;
4)关节组织 HE 染色,观察滑膜组织炎症细胞浸润和FLS增生程度;
5)Safranine-O 染色;
6)Micro-CT 对小鼠后踝关节进行扫描并通过 Explore
Reconstruction Utility 软件对关节结构进行三维重建;
7)小鼠血清中 TNF-α、IL-1β、IgG2a 的检测;
8)小鼠关节腔内 TNF-α、IL-1β、IgG2a 的检测;
9)TRAP染色检测破骨细胞;
10)碱性磷酸酶染色检测成骨细胞。
3.1.2 取RA FLS、CIA小鼠和hTNFtg小鼠FLS,采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷体(5-Brdu)标记上述细胞后与人软骨按比例植入SCID小鼠皮下。术后1个月进行按照3.1.1.中的分组给药,并于给药1个月之后处死各组小鼠并按照如下方案检测对FLS侵袭软骨的能力:
1)取血检测TNF-α、IL-1β、IgG2等炎性因子和抗体的表达;
2)连带软骨附近的皮肤与组织一同取下后固定,HE染色观察滑膜组织炎症细胞浸润和FLS增生程度;
3)Safranine-O染色检测软骨组织破坏程度;
4)免疫组织化学法检测标记的Brdu抗体和FLS标记物Vimentin抗体。
3.2 DDA对关节炎的治疗效果:
3.2.1 将CIA小鼠和hTNFtg小鼠分为对照组、模型组、轻度治疗组(10mg/kg)和重度治疗组(20mg/kg),每组10只。轻度治疗组在评分为1~2 时腹腔注射DDA,隔天给药一次,给药第70d 评价DDA对轻度的治疗效果;重度治疗组在评分 6~8 时开始腹腔注射DDA,隔天给药一次,造模第42d 评价DDA对重度的治疗效果,具体评价指标及方法同3.1.1。
3.2.2 按照3.2.1中的给药分组,给药1个月后处死各组小鼠并按照3.1.2中介绍的实验方案检测对FLS侵袭软骨的能力。
4. 阐明DDA在RA FLS中影响炎性反应和凋亡异常的分子机制
4.1药物亲和反应性靶点稳定性(drug affinity responsive target stability,DARTS)实验鉴定单体作用蛋白。
1)含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物的600ul M-PER细胞裂解液裂解细胞,置于冰上裂解20min后在4℃,12000rpm离心15min,上清转移至新的离心管, 加66ul
10×TNC缓冲液,BCA法测蛋白浓度,用裂解液稀释浓度至5mg/ml。
2)将符合浓度的蛋白样品分为两份,分别用PBS缓冲液或DDA在室温下孵育1h。再将两个蛋白质样品各等分为3管,1管作为非酶解对照,另外2管在室温下与1:100和1:1000链酶蛋白酶溶液孵育30分钟;加入5×SDS蛋白上洋缓冲液停止酶解,100℃煮5min。
3)对所有样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色后切下特异性条带,质谱鉴定靶蛋白。
4.2 DDA对潜在靶蛋白的调控
采用DDA处理RA FLS后提取总蛋白,检测DDA对潜在靶蛋白表达的影响,从而进一步确定DDA作用的靶蛋白。
4.3 DDA是否通过靶蛋白发挥作用
采用DDA处理RA FLS的同时沉默靶蛋白表达,按照实验方案2检测RA FLS活性,明确DDA是否通过靶蛋白发挥作用。