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一、项目进展情况及取得成果
项目进展情况:按计划进行
主要研究阶段(起止时间) 研究内容 完成情况
2018.08-2018.10采用OSMAC策略发掘长枝木霉TDW2次生代谢能力,并制备发酵液中不同次级代谢产物组分群。已完成
2018.10-2019.03对不同次级代谢产物组分群进行化学分析与QS抑制活性筛选,并从具有QS淬灭效应的次级代谢产物中分离鉴定活性单体化合物。已完成
2019.03-2019.08评价不同活性化合物抑制QS的能力并利用分子对接及动力学模拟方法,模拟QS抑制剂与受体蛋白的结合过程,阐明其作用机制。正在进行
项目研究成果(已取得的成果)
序号 项目成果名称 成果形式
 
二、项目中期报告

本项目已顺利进行了研究工作计划的前三部分,即利用OSMAC策略深入发掘海洋源真菌T.longibrachiatum TDW2的次级代谢能力、发酵代谢产物的QS抑制活性筛选及化学分析以及从具有QS抑制活性的次级代谢产物中分离纯化活性单体化合物并进行结构鉴定和QS抑制活性评价,具体开展情况如下:

1)菌株活化:

保藏于-80℃的菌株接种于含有3.3%氯化钠的PDA培养基上进行复苏。

2OSMAC策略获得多种粗提物浸膏:

本项目经过调研文献,选用了真菌2号、真菌3号、真菌5号、豆粉、甘油、寡营养、PeterPYGPDA、大米共10种培养基进行海洋源真菌TDW2的小发酵培养,发酵结束后,用等量的乙酸乙酯对发酵液进行萃取3遍,合并后真空浓缩得各培养条件下的粗提物浸膏,称重,甲醇溶解配制25mg/ml的溶液,0.22um滤膜过滤后,备用。

3TLCHPLC分析:

对以上获得的粗提物浸膏进行化学分析,分别通过TLCHPLC指纹图谱方法检测各培养条件下次级代谢产物的种类及含量,从中分析获得3种较优的发酵条件。

4)菌株TDW2的规模化发酵:

采用选择的大米培养基进行菌株TDW2的规模化发酵,以每三角瓶80g大米/120ml去离子水为标准配制大米培养基,共发酵50瓶。高压灭菌后,接入菌株TDW2进行静置发酵,温度25℃,培养35天。培养结束后,先用甲醇进行浸提3次,浓缩获得的水溶液再采用乙酸乙酯萃取3次,减压浓缩获得总提取物浸膏。

5)大米发酵提取物的分离与结构鉴定:

从大米发酵提取物中分离获得利用各种柱层析、高效液相色谱和薄层层析等手段和活性追踪的方法从大米发酵提取物中分离纯化真菌代谢产物,得到单体化合物,然后利用质谱(MS),核磁共振波谱(1H-NMR13C-NMR)及其他波谱手段测定活性化合物结构4-羟基苯乙醇和环(酪氨酸-脯氨酸)。

6)单体化合物QS抑制活性评价

对分离得到两种化合物进行QSI活性评价,以C. violaceum CV026P. aeruginosa PA01为模型,评价活性分子化合物淬灭细菌QS的能力,以紫色素产量为指标,评估化合物抑制QS系统的能力活性化合物4-羟基苯乙醇和环酪氨酸-脯氨酸在不抑制细菌生长的浓度范围内,能抑制CV026紫色素的产量,随着化合物浓度的增加,紫色素产量逐渐减少,当化合物浓度为0.5mg/ml 时,对紫色素的抑制量分别为53.48%78.67%60.51%。化合物4-羟基苯乙醇和环酪氨酸-脯氨酸能干扰PA01QS系统活性,在对菌体生长不抑制的浓度下,化合物4-羟基苯乙醇和环酪氨酸-脯氨酸均对PA01的绿脓菌素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶、生物被膜等致病因子有抑制作用,随着化合物浓度的增加,毒力因子产量逐渐降低,说明活性化合物H1H2能干扰PA01QS系统,不破坏细菌正常生长。

本项目的研究工作达到了项目计划的预期目标。

 
三、经费使用明细情况
项目获批总经费(元) 已使用项目研究经费(元) 已报销金额(元) 未报销金额(元)
20000 0 0 0
项目经费开支情况
名目 用途 金额(元) 备注
论文版面费
专利申请费
调研、差旅费
打印、复印费
资料费
试剂等耗材费
元器件、软硬件测试、小型硬件购置费
其它
 
四、项目后期具体工作计划

1、单体化合物环酪氨酸-脯氨酸的QS抑制活性评价。

2、采用分子对接方法模拟化合物与受体蛋白的相互作用,初步探讨其分子作用机制。

 
五、指导教师意见

该项目自立项后,小组成员积极投入到项目的实施计划中,按照项目原定研究工作计划顺利进行,目前通过OSMAC策略获得3种较优的菌株发酵培养条件,并采用大米培养基进行了大量发酵,得到粗提物。对粗提物进行单体化合物分离已获得两个具有QS抑制活性的化合物,取得了预期效果,为下一步的研究工作实施奠定了基础。

 
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