负责人为16级药学专业学生，已主修过无机化学、有机化学，分析化学，生理，生化，系解，组胚，病理，病生，免疫，微生物等课程，具有较好的专业素养；亲自操作过各类学科的实验，对实验设计、实验流程、结果分析方法等有一定知识储备，以及拥有较为熟练的实验仪器操作技能。

1.山东省自然科学基金项目，ZR2018BD030，海洋真菌长梗木霉TDW2的群体感应抑制活性产物及淬灭机理研究，在研，主持；

2.国家自然科学基金青年项目，41706077，卤盐胁迫盐生药用植物内生真菌的群体感应抑制活性产物研究，在研，第三位；

  联合国世界卫生保健组织（WHO）发表的2014年报告书中指出，突然变异的、对抗生素具有强力耐药性的细菌的发病感染，使人类的生存受到巨大威胁，解决越来越严重的细菌耐药性问题已成为全球关注的重大难题^1-2。目前使用的抗生素都是通过直接杀死微生物或抑制微生物生长来实现抗感染的目的，在这种生存压力下，细菌通过改变自身机制，很容易产生耐药性。近年来，细菌群体感应被视为开发抗感染药物的新靶点，受到了高度重视。细菌群体感应参与多种致病菌的生物学功能³，比如促进毒素的产生、生物被膜的形成、细菌运动、生物发光等。如果破坏病原菌株间的信息交流，即抑制QS系统，则可以瓦解细菌群体间的协同作用，从而抑制病原菌的侵袭力和致病性。由于这种方式并不直接干扰细菌的生长，因而不易对病原菌产生选择性生存压力，不易诱导耐药突变。因此，寻找高效的QS抑制剂有望成为解决耐药细菌感染的有效途径之一。

本研究拟以首次筛选到的具有细菌QS淬灭活性的海洋真菌长梗木霉（T. longibrachiatum）TDW2为研究对象，采用OSMAC策略深入发掘次生代谢能力，利用紫色杆菌(Chromobacterium violaceum CV026)、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa PA01）QS系统模型及HPLC-DAD-MS 技术平台快速分析不同条件下海洋真菌T. longibrachiatum TDW2发酵产物中淬灭细菌QS系统的活性作用因子及其分子结构；同时利用蛋白质工程技术和分子模拟手段，分析淬灭因子与QS系统受体蛋白的关键氨基酸结合位点及各种结合常数解析其分子作用机理。其主要研究内容如下：

[1]利用OSMAC策略深入发掘海洋真菌T. longibrachiatum TDW2的次级代谢能力

利用OSMAC策略改变培养环境（如改变培养基的成分、比例，改变培养的时间、温度，改变接种量，改变培养方式等），尽可能发掘菌株T. longibrachiatum TDW2次级代谢的能力；同时采用添加前体、酶抑制剂等方式，反馈调控菌株产生次级代谢产物的能力，以获得更多结构复杂、新颖，活性独特的代谢产物。

[2]发酵代谢产物的QS抑制活性筛选及化学分析

在不抑制紫色杆菌C. violaceum CV026菌体生长的前提下，以紫色素产量为指标，评估不同次级代谢产物组分群抑制QS系统的能力。同时，采用HPLC-DAD-MS技术平台及HPLC、TLC化学筛选手段判断发酵代谢产物化合物的差异性和结构多样性，并确定目标发酵方式。

[3]从具有QS淬灭效应的次级代谢产物中分离纯化活性单体化合物并进行结构鉴定

利用多种柱色谱手段（正相、反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱等）结合HPLC-DAD-MS技术平台，分离次级代谢产物中淬灭细菌QS系统的活性单体化合物；采用HRMS，1D-NMR，2D-NMR，X-Ray等波谱学手段及化学方法进行分子结构鉴定，并评价结构的新颖性。

[4]单体化合物的QS淬灭活性评价及分子作用机理研究

在添加外源性信号分子的条件下，以紫色素产量为指标，比较不同活性化合物淬灭细菌C. violaceum CV026 QS的能力；同时以绿脓菌素、弹性蛋白酶的产量、生物被膜的形成量以及集群运动为指标，评价不同活性化合物抑制铜绿假单胞菌QS系统的能力；采用Autodock、Gramacs分子模拟软件对QS淬灭因子与受体蛋白进行分子对接及动力学模拟，推测受体配体相互作用的关键氨基酸位点及结合前后的空间构像变化初步解析QS抑制剂的作用机理。

1．项目的研究意义、学术价值及应用前景

抗生素的广泛使用，致使越来越多的致病菌产生了耐药性，因此，开发新型的抗生素和建立新的治疗模式十分必要。群体感应（Quorum sensing, QS）是指细菌利用自身产生的化学信号分子来监测自身细胞密度的变化，进而调控个体基因表达的一种群体行为。如果破坏病原菌株间的信息交流，则可以瓦解细菌群体间的协同作用，从而抑制病原菌的侵袭力和致病性。由于这种方式并不直接干扰细菌的生长，因而不易对病原菌产生选择性生存压力，不易诱导耐药突变。因此，寻找高效的QS抑制剂有望成为解决耐药细菌感染的有效途径之一。在前期工作基础中从青岛黄海海域泥沙样品中分离纯化一株具有较强QS抑制活性的真菌菌株TDW2。本项目以该活性菌株为研究对象，采用OSMAC策略深入发掘其产生次级代谢产物的能力，利用紫色杆菌和铜绿假单胞菌QS模型系统评价活性化合物淬灭细菌QS的效应，同时利用分子模拟手段，分析淬灭因子与QS系统受体蛋白的关键氨基酸结合位点及各种结合常数，解析其分子作用机理。本课题应用的研究方法和手段可用于指导海洋真菌次级代谢产物的深入开发，同时为新型天然抗菌先导药物的研发提供科学依据。本项目方案预期获得的新颖QS抑制剂化学单体，本身或者是通过结构修饰极有可能成为新型抗菌药物的先导结构，从而进行临床前药物的评价，对于解决目前临床上出现的严重的多药耐药性问题提供了一条快速易行的途径，具有重大的应用前景

2．主要研究内容、研究方法与研究结果

2.1 主要研究内容及研究方法

[1]利用OSMAC策略深入发掘海洋真菌T. longibrachiatum TDW2的次级代谢能力

利用OSMAC策略改变培养环境（如改变培养基的成分、比例，改变培养的时间、温度，改变接种量，改变培养方式等），尽可能发掘菌株T. longibrachiatum TDW2次级代谢的能力；同时采用添加前体、酶抑制剂等方式，反馈调控菌株产生次级代谢产物的能力，以获得更多结构复杂、新颖，活性独特的代谢产物。

[2]发酵代谢产物的QS抑制活性筛选及化学分析

在不抑制紫色杆菌C. violaceum CV026菌体生长的前提下，以紫色素产量为指标，评估不同次级代谢产物组分群抑制QS系统的能力。同时，采用HPLC-DAD-MS技术平台及HPLC、TLC化学筛选手段判断发酵代谢产物化合物的差异性和结构多样性，并确定目标发酵方式。

[3]从具有QS淬灭效应的次级代谢产物中分离纯化活性单体化合物并进行结构鉴定

利用多种柱色谱手段（正相、反相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱等）结合HPLC-DAD-MS技术平台，分离次级代谢产物中淬灭细菌QS系统的活性单体化合物；采用HRMS，1D-NMR，2D-NMR，X-Ray等波谱学手段及化学方法进行分子结构鉴定，并评价结构的新颖性。

[4]单体化合物的QS淬灭活性评价及分子作用机理研究

在添加外源性信号分子的条件下，以紫色素产量为指标，比较不同活性化合物淬灭细菌C. violaceum CV026 QS的能力；同时以绿脓菌素、弹性蛋白酶的产量、生物被膜的形成量以及集群运动为指标，评价不同活性化合物抑制铜绿假单胞菌QS系统的能力；采用Autodock、Gramacs分子模拟软件对QS淬灭因子与受体蛋白进行分子对接及动力学模拟，推测受体配体相互作用的关键氨基酸位点及结合前后的空间构像变化，同时利用蛋白质工程手段及生物物理技术，分析QS抑制剂与受体蛋白的各种结合参数（结合常数、结合位点数、焓、熵及淬灭速率常数），并解析QS抑制剂的作用机理。

2.2 研究结果

[1]本项目运用OSMAC策略成功的获得4种优化培养基（大米、真菌2号、Peter、寡营养）能够产生具有较强QS抑制活性代谢产物。

[2]本项目从大米培养基的粗提物中分离获得4个化合物，分别鉴定为Tyrosol、cyclo(Tyr-Pro) 、 Spirosorbicillinol B 、 Spirosorbicillinol C，（结构式见下图）其中Tyrosol、cyclo(Tyr-Pro) 2个化合物具有较强的QS抑制活性。

[3]活性化合物在不抑制细菌生长的浓度范围内，对紫色杆菌和铜绿假单胞菌都具有QS抑制活性。具体表现为对紫色素、绿脓菌素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶、生物被膜等致病因子的抑制作用。以C. violaceum CV026和P. aeruginosa PA01为模型，评价活性分子化合物淬灭细菌QS的能力，以紫色素产量为指标，评估化合物抑制QS系统的能力。活性化合物Tyrosol、cyclo(Tyr-Pro)在不抑制细菌生长的浓度范围内，能抑制CV026紫色素的产量，随着化合物浓度的增加，紫色素产量逐渐减少，当化合物浓度为0.5mg/ml 时，对紫色素的抑制量分别为53.48%、78.67%。化合物Tyrosol、cyclo(Tyr-Pro)能干扰PA01的QS系统活性，在对菌体生长不抑制的浓度下，化合物Tyrosol、cyclo(Tyr-Pro)均对PA01的绿脓菌素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶、生物被膜等致病因子有抑制作用，随着化合物浓度的增加，毒力因子产量逐渐降低；在Tyrosol浓度为0.5mg/ml 时，使绿脓菌素降低63.3%，弹性蛋白酶降低57.78%，蛋白水解酶降低9.89%，在有化合物Tyrosol的情况下生物被膜被破坏，将细菌裸露在外部，而细菌菌体保持完整。在cyclo(Tyr-Pro)浓度为0.5mg/ml 时，使绿脓菌素降低39.13%，弹性蛋白酶降低38.98%，蛋白水解酶降低12.52%，在有化合物cyclo(Tyr-Pro)的情况下生物被膜被破坏，将细菌裸露在外部，而细菌菌体保持完整，说明活性化合物Tyrosol、cyclo(Tyr-Pro)能干扰PA01的QS系统，不破坏细菌正常生长。

    分子对接结果，推测化合物Tyrosol与cyclo(Tyr-Pro)的作用方式是不同的，化合物Tyrosol处在DNA结合区域，与信号分子C₆HSL处在不同的活性口袋里，当与受体蛋白CviR结合后，改变了受体蛋白的活性构想，使之不能与相应的DNA结合，因而不能启动相关基因的表达；而化合物cyclo(Tyr-Pro)处在配体结合区域，与信号分子C₆HSL处在同一个活性口袋里，可能是与信号分子AHLs竞争性结合受体蛋白的同一活性位点，从而不能完成相应的生理学功能，不能合成紫色素。

3.同预期计划和目标比较，说明存在问题与建议

同预期计划和目标比较，本项目较好的完成了预期计划研究内容，获得了相应的研究成果。但也存在一定的问题，一是获得的研究结果未及时转化成论文或专利发表出来；二是对QS抑制剂与受体蛋白的互作机理计算机模拟研究中，未进行分子动力学模拟，只有分子对接的结果难以很好的支撑互作机制的解析。建议如下：

1. 为解析小分子与受体蛋白结合的作用机理，还需要结合分子动力学和蛋白质工程等动态手段精确模拟底物和受体蛋白结合过程，开展配体受体相互作用的影响因素和作用机理研究；

2. 对关键氨基酸进行敲除，进而完整阐述群体感应抑制机理。为新型抗菌先导药物的设计与研发提供理论基础

创新点：

[1]本项目首次阐明海洋来源T.longibrachiatum种真菌的次生代谢产物具有QS抑制活性，在研究对象上具有创新性；

[2]本项目首次采用OSMAC策略联合分子模拟与蛋白质工程手段发现并阐明QS抑制剂与受体蛋白的作用机理，在研究方法上具有明显的创新性。

特色：

海洋真菌来源的具有QS抑制活性化合物的报道非常稀少，本项目的实施可丰富具有QS抑制活性的海洋源真菌种类及次生代谢产物的结构类型，并可为QS抑制活性先导化合物的发现提供优质海洋源菌株资源。

本项目在5位本科生的共同努力下，项目进展情况顺利，圆满的完成了预期计划，5位同学在项目进行过程中，工作态度认真负责，对实验内容充满兴趣与求知欲，积极主动的自己动手设计及完成实验，在实验过程中能运用本专业所学专业知识，进行分析并解决问题，表现出较好的学识水平与实际应用能力。

海洋真菌来源的具有QS抑制活性化合物的报道非常稀少，本项目的实施获得了2个具有较好QS抑制活性的海洋源小分子化合物，丰富了具有QS抑制活性的海洋源真菌种类及次生代谢产物的结构类型，并可为QS抑制活性先导化合物的发现提供优质海洋源菌株资源。本项目方案获得的QS抑制剂若是和企业联合深入开发，采用动物实验评价其自身或者和抗生素联合用药的药效，并对其进行结构修饰，有望开发成为新型抗菌先导化合物。作为新型的不对致病菌本身产生生存压力的抗菌药物，能够克服现有抗生素的耐药性问题，有着潜在的巨大经济和社会效益。